BACPAC——FISH克隆基因DNA產物

BACPAC

鏈接：https://bacpacresources.org/

BACPAC基因組學是由初在紐約州布法羅市Roswell Park癌癥研究所（2000年以前）和美國加利福尼亞州奧克蘭市CHORI的學術實驗室創建BAC（和PAC）庫的科學家們于2000年至2020年間創建的。包含了由BAC、PAC或Fosmid克隆組成的可用基因組DNA文庫、一些cDNA文庫、文庫篩選試劑（高密度克隆雜交過濾器）以及BAC、PAC和Fosmid克隆載體的信息。自2019年9月1日起，BACPAC資源不再在奧克蘭兒童醫院研究所運營，所有訂單均由一家小型公司“BACPAC Genomics"處理，該公司初位于加利福尼亞州Richmond。

通過BAC修飾（BAC modification/recombineering），我們可以將報告基因放置在BAC特定的調控序列之后，也可以將點突變引入目的基因、或是將BAC上的片段轉移到質粒載體上以及在BAC骨架上添加篩選標記等。

服務說明

為您購買BAC

如果您知道您需要的BAC的ID號，請提供給我們，我們將為您購買。如果對使用的BAC有疑惑，我們也可以根據您研究的基因為您找到合適的BAC。絕大多數BAC可從CHORI 的BACPAC資源中心獲取，但某些BAC需要從其他供應商購買。您也可以直接給我們寄送含有BAC的大腸桿菌。

“一步法BAC修飾"

既可用于引入大片段如在某個基因的啟動子后面加上用于示蹤的報告基因（圖1），也可引入小改變，如點突變（圖2）。

大片段的引入（圖1）：片段包含有目的基因（GOI）（例如LacZ或GFP報告基因）、兩側為FRT位點的藥物篩選表達框，其兩端具有與重組區域同源的同源臂。通過同源重組來替代BAC上的內源區域，藥物篩選表達盒可用于鑒定成功修飾的BAC克隆，可通過Flp介導的重組刪除該表達盒，只留下一個FRT位點。

圖1. “一步法BAC修飾"示意圖：在啟動子后面引入目的基因（GOI）(如LacZ或GFP報告基因)

引入點突變（圖2）：片段包含突變區域、兩側為FRT位點的藥物篩選表達框，其兩端具有與重組區域同源的同源臂。通過同源重組取代BAC上的內源區域，最后通過Flp介導的重組刪除該表達盒，只留下一個FRT位點。FRT位點被認為是“瘢痕"序列，因為修飾后的BAC除了所需的點突變之外，還攜帶這個殘留的FRT。為了不影響基因功能，該瘢痕序列要放置在基因的非功能區域，如內含子或UTR區。

圖2. “一步法BAC修飾"示意圖：在基因的第一外顯子中引入點突變并將FRT序列放置在下游內含子中

“兩步法BAC修飾"

“兩步法BAC修飾"用于將微小的變化（如點突變）引入BAC，而不留下FRT瘢痕序列（圖3）。該方法適用于以下情況，即在預期突變位點的附近，沒有合適的空間放置殘留的FRT瘢痕序列。例如，如果要修飾的基因是非常大的單外顯子基因，并且所需的突變位點位于基因的中間，則在點突變附近沒有合適的位置來放置瘢痕序列。在這種情況下，應該使用兩步法，該方法利用表達藥物篩選標記的基因片段進行陽性和陰性篩選（圖3）。第一步，使用該基因片段進行同源重組來替代內源靶區域，通過藥物陽性篩選獲得成功重組的BAC；第二步，通過同源重組，使用包含突變位點的片段替代藥物篩選基因片段，利用陰性選擇篩出實現點突變的BAC。

圖3. “兩步法BAC修飾"示意圖：在大的單個外顯子基因中引入點突變而不留下瘢痕序列

將篩選標記添加到BAC骨架上

使用該類BAC轉染到細胞時，BAC骨架上的篩選標記將有利于其在細胞中被篩選或示蹤，這將有利于通過藥物篩選分離含有穩定整合BAC的細胞。

將BAC上的片段轉移到質粒載體上

我們可以將BAC的任何區域（可達60 kb）轉移到質粒載體上單獨進行研究。例如，如果利用整個BAC構建轉基因小鼠以研究在BAC上某個基因的功能，同一BAC上的其他基因可能會對研究結果有影響，而將目的基因單獨分離到質粒上并使用該質粒構建轉基因小鼠可以避免這個問題。另外，在技術層面，使用質粒比使用BAC更加簡單。

BAC修飾的鑒定

BAC修飾區域將通過測序鑒定。由于重復序列的存在，BAC可能會發生片段缺失。為了降低這種可能性，我們將重新轉化修飾后的BAC，并挑選獲得單克隆，通過在整個BAC上進行多個位點的PCR擴增來確認其沒有發生大片段缺失。

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